kultur jaringan pembuatan media

LAPORAN PRAKTIKUM

KULTUR JARINGAN

ACARA II

PEMBUATAN MEDIA

Semester :

Genap 2012/2013

Oleh:

Nama              : Yunita Fajri Pertiwi

NIM                : A1L011128

Rombongan   : E

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS PERTANIAN

PURWOKERTO

2012

A.    JUDUL : PEMBUATAN MEDIA

B.     PENDAHULUAN

a.       Latar Belakang

            Prinsip dasar kultur jaringan tanaman adalah bahwa setiap sel dalam tubuh organisme merupakan suatu unit otonom yang totipotensi, yaitu kemampuan tipa sel yang berasal dari semua bagian tanaman untuk tumbuh menjadi tanaman sempurna jika di letakkan pada media dan lingkungan yang sesuai.

Keberhasilan kultur jaringan ditentukan oleh media tanam dan jenis tanaman. Campuran media yang satu mungkin cocok dengan jenis tanaman tertentu, namun tidak cocok untuk jenis tanaman yang lain. Hal ini disebabkan karena setiap spesies tanaman dan bagian dari tanaman mempunyai kemampuan yang tidak sama dalam mensintesa atau merombak zat- zat yang menyusun media. Oleh karena itu tidak ada formulasi yang sesuai untuk semua jenis tanaman yang  menyebabkan diciptakannya berbagai macam media yang disesuaikan dengan jenis tanaman yang akan dikulturkan (Hendaryono, 1994).

Media kultur  jaringan merupakan tempat tumbuh bagi eksplan .Untuk menjamin pertumbuhan eksplan yang ditanam, media kultur jaringan tanaman harus berisi semua zat yang diperlukan media tersebut dan harus berisi garam mineral berupa unsur makro dan mikro, gula, protein, vitamin, dan hormon tumbuh.

Media kultur jaringan harus mengandung unsur hara makro dan unsur hara mikro dalam kadar perbandingan tertentu, sumber energi (sukrosa), satu atau dua macam vitamin dan zat pengatur tumbuh. Unsure-unsur yang diberikan dalam bentuk garam organic, unsure hara makro sangat menunjang pertumbuhan  jaringan dan diberikan dalm jumlah banyak dari unsur mikro. Unsur hara mikro meliputi Nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Sulfur(S), Kalsium (Ca), dan Magnesium (Mg), Seng(Zn), Bor(B), molibdemnum (mo).

Zat pengatur tumbuh (ZPT) sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan differensiasi. Tanpa penambahan ZPT dalam medium, pertumbuhan mungkin terhambat bahakan tidak tumbuh. Golongan auksin yang sering digunakan pada medium kultur jaringan adalah 2,4D, IAA, NAA, dan IBA. Sedangkan dari golongan sitokinin adalah kinetin, zeatin, BAP. Konsentrasi yang digunakan untuk masing-masing tanaman dan bagian tanaman tidak sama.

Tanaman memerlukan makanan yang sering disebut hara tanaman (plant nutrient). Tanaman menggunakan bahan anorganik untuk mendapatkan energi dan pertumbuhannya. Dengan fotosintesis, tanaman mengumpulkan karbon yang ada di atmosfir yang kadarnya sangat rendah, ditambah dengan air diubah menjadi bahan organik oleh klorofil dengan bantuan sinar matahari. Unsur yang diserap untuk pertumbuhan dan metabolisme tanaman dinamakan hara tanaman. Mekanisme pengubahan unsur hara menjadi senyawa organik atau energi disebut metabolisme (Anonim, 2007).

Nutrisi dasar untuk kultur sel tanaman pada dasarnya mirip dengan nutrisi yang dibutuhkan oleh tanaman itu sendiri.  Namun, variasi  komposisi nutrisi tergantung pada sel-sel, jaringan-jaring, organ-organ dan protoplasma serta jenis tanaman yang akan dikulturkan. Komposisi media yang diguanakan untuk menumbuhkan eksplan harus mengandung nutrien esensial makro dan mikro dengan perbandingan komposisi tertentu yang sesuai dengan kebutuhan jenis dan varietas tanaman yang dijadikan eksplan. Nutrien esencial makro terdiri atas 6 elemen makro nutrien yang terdiri atas: nitrogen, kalium, magnesium, kalsium, belerang dan fosfor serta tujuh eleven mikro yang terdiri atas besi, mangan, seng, tembaga, boron, molibden, dan khlor dalam bentuk ikatan kimia dan perbandingan yang sesuai (Wetherell, 1982)

b.      Tujuan

Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa dapat:

1.      Mengetahui dan mempraktikan cara membuat larutan stok.

2.      Mengetahui dan mempraktikan cara membuat media MS.

3.      Melakukan sterilisasi medium.

C.     METODE PELAKSANAAN

Tempat pelaksanaan          : Di ruang lab pemuliaan tanaman.

Waktu                               : 28 november 2012

a.       Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam pembuatan media MS adalah tabung erlenmeyer, gelas ukur, pipet ukur, pengaduk, magnetic stirer, kompor, pH meter, timbangan analitik, autoclave, dan alumunium foil, seal, dan kertas payung.

Bahan yang digunakan dalam pembuatan media MS adalah unsur hara makro : 1900 mg/l KNO3, 1650 mg/l NH4NO3, 440 mg/l CaCl2. 2 H2O, 370 mg/l MgSO4, 170  mg/l ; unsur hara mikro : MnSO4. 4 H20 22,3 mg/l, ZnSO4. 7 H2O 8,6 mg/l, M3BO3 6,2 mg/l, KI 0,83 mg/l, Na2MoO4.2H20 0,25 mg/l, CuSO4.5H20 0,025 mg/l ; besi : FeSO4.7H2O 27,8 mg/l, Na2-EDTA.2H2O 37,3 mg/l ; vitamin : Mio-inositol 100 mg/l, Thiamin HCl 0,1 mg/l, Asam nikotinat 0,5 mg/l, Piridoksin HCl 0,5 mg/l, Glisin 2 mg/l ; ZPT : sitokinin 1 mg/l, auksin 1 mg/l ; bahan pemadat (agar) : 7 gr/l ; sukrosa : 30 gr/l ; KOH atau NaOH : 1 M ; HCl : 1 M.

a.       Prosedur Kerja

1.    Pembuatan Larutan Stok

a.    Larutan stok A merupakan larutan hara makro, dibuat 10 kali dilarutkan sampai 1000 ml aquades.

b.   Larutan stok B merupakan larutan hara mikro, dibuat 1000 kali  dilarutkan dalam 100 ml aquades.

c.    Larutan stok C merupakan campuran FeSO₄.7H₂O dan Na₂-EDTA, dibuat 100 kali dan dilarutkan kedalam 200ml aquades.

d.   Larutkan stok D merupakan larutan vitamin kecuali mio-inositol, dibuat 100 kali dalam 200 ml aquades.

e.    Larutan stok E merupakan larutan mio-inositol , dibuat 100 kali dan dilarutkan ke dalam 100 ml aquades.

f.    Larutan stok F merupakan larutan ZPT, dibuat 100 kali dilarutkan kedalam 500 ml aquades.

2.   Pembuatan Media MS

a.    Aquades sebanyak 500 ml dipersiapkan di dalam erlenmeyer ukuran 1000 ml. Larutan stok A, B, C, D, E, dan F dimasukkan kedalam erlenmeyer sesuai dengnan yang dibutuhkan. Untuk pembuatan 1 liter medium, maka stok A diambil sebanyak 100 ml, stok B 0,1 ml, stok C 2 ml, stok D 2 ml, stok E 1 ml, dan stok F 5 ml. Semua larutan dicampur sambil digoyangkan wadahnya agar semua bahan kimia tersebut larut.

b.    Sukrosa ditimbang sebanyak 30 gr dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer (pada pointa) sambil diaduk sampai homogen.

c.    Aquades ditambahkan sampai volumenya 1000 ml.

d.   pH larutan diukur dengan menggunakan pH meter elektrik atau kertas lakmus, pH yang diutuhkan sekitar 5,7-5,8. Jika terlalu asam maka larutan ditambahkan KOH atau NaOH 1 M dan jika terlalu basa dapat ditambahkan HCl 1 M. Penambahan bahan tersebut dilakukan hingga pH yang diinginkan tercapai.

e.    Agar-agar ditambahkan ke dalam larutan tersebut sebanyak 7 gr, lalu dipanaskan di atas kompor sampai mendidih sambil di aduk-aduk.

f.     Medium dituangkan ke dalam botol kultur sekitar 20 ml per botol tergantung ukuran botol.

g.    Botol ditutup dengan alumunium foil kemudian direkatkan menggunakan seal.

3.        Sterilisasi Media

a.    Botol kultur yang sudah berisi medium dimasukkan ke dalam autoclave untuk disterilisasi dengan tekanan botol 15-17,5 psi pada suhu 120ºC selama 20 menit sampai tiga kali.

b.    Setelah disterilkan, botol-botol yang berisi medium diangkat dan disimpan dalam ruangan sejuk sampai siap digunakan..

c.    Medium siap digunakan, namun untuk mengetaui ada tidaknya kontaminasi dalam medium sebalikya.

D.    PEMBAHASAN

Beberapa macam media dasar yang dikenal antara lain (Hendaryono, 1994):

1.      Médium dasar Murashige dan Skoog (MS). Media ini mempunyai konsentrasi garam – garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+.

2.      Médium dasar B5 atau Gamborg. Digunakan untuk kultur suspensi sel bangsa legume.

3.      Médium dasar white. Digunakan untuk kultur akar mengandung konsentrasi garam – garam mineral yang rendah.

4.      Médium Vacin Went (VW). Digunakan sebagai médium anggrek.

5.      Médium dasar Nitsch dan Nitsch. Digunakan untuk kultur tepungsari (pollen) dan kultur sel.

6.      Médium dasar Schenk dan Hildebrandt. Digunakan untuk kultur jaringan tanaman monokotil.

7.      Médium dasar Woody Plant Médium (WMP). Digunakan untuk tanaman berkayu.

8.      Médium dasar N6. Digunakan untuk tanaman serealia terutama padi.

Media dasar terdapat dalam bentuk kemasan dan lebih praktis, Namur karena harganya masih relatif mahal, maka para peneliti berupaya meramu komposisi media sendiri. Untuk unsur makro komposisi masing – masing campurannya cukup ditimbang.

 Praktikum kali ini dalam pembuatan media ini adalah menggunakn media MS, dari berbagai komposisi  dasar ini kadang-kadang dibuat modifikasi, misalnya hanya menggunakan (½ MS), atau menggunakan komposisi garam –garam makro berdasarkan MS tetapi mikro dan vitamin berdasarkan komposisi Heller. Zat pengatur tumbuh yang akan digunakan disesuaikan dengan tujuan  inisiasi kultur, setelah rencana media tanam dimantapkan, dibuat laruta stok yang pekat.

Praktikum kali ini yaitu melakukan pembuata media Murashige and Skoog (MS).  Media ini terdiri dari berbagai larutan stok, diantaranya larutan stok A atau unsur hara makro (NH₄NO_3, KNO_3, C_aCl_2, 2H₂O, M_gSO_4, 7H₂O dan KH₂PO₄), larutan stok B atau unsur hara mikro (M_nSO_4, 4H₂O, Z_nSO_4, 4H₂O, H₃BO_3, Kl, N_aM₀O_4, 2H₂O, C_uSO_4, H₂O, dan C₀Cl_2. 6H₂O), larutan stok C (FeSO4.7H2O, Na2-EDTA), larutan stok D atau vitamin (Mio-inositol, air kelapa), larutan stok E (ZPT), glukosa, dan agar.  Pembuatan larutan stok ini bertujuan untuk memudahkan penimbangan bahan-bahan yang digunakan karena penggunaannya yang sangat sedikit.  Larutan stok ini mempunyai kepekatan yang sangat tinggi sehingga pemakaiannya harus disesuaikan dengan kebutuhan (Mardin, 2005).

Penambahan Mio-inositol pada media kultur bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan. Bila mio-inositol diberikan bersama auksin, kinetin dan vitamin, maka dapat mendorong pertumbuhan jaringan kalus (Daisy dan Ari, 2002).

Larutan stok adalah larutan bahan media yang dibuat dalam jumlah atau volume besar.  Pembuatan larutan stok bertujuan untuk menghemat pekerjaan menimbang bahan yang berulang-ulang setiap kali membuat media.  Larutan stok sebaiknya disimpan di tempat yang bertemperatur rendah dan gelap (dianjurkan untuk disimpan dalam lemari es).

Fungsi kandungan unsur  makro

1. KNO₃

Berfungsi memperkuat tubuh tanaman, karena unsur KNO₃ ini dapat menguatkan serabut-serabut akar, sehingga daun, bunga dan buah tidak mudah gugur. Disamping itu juga berfungsi memperlancar memetabolisme dan mempengaruhi penyerapan makanan.

2. NH4NO₃

Berfungsi menyuburkan tanaman sabab dapat membentuk protein, lemak dan berbagai persenyawaan organik lainnya. NH4NO₃ juga digunakan dalam pertumbuhan vegetative tanaman, pembentukan hijau daun yang sangat dimanfaatkan dalam proses fotosintesis.

3. CaCl₂.2H₂O

Berfungsi merangsang pembentukan bulu-bulu akar, mengeraskan batang dan merangsang pembentukan biji.

4. MgSO₄.7H₂O

Berfungsi dengan terbentuknya sejumlah protein maka pertumbuhan daun menjadi hijau, terbentuk karbohidrat, lemak serta minyak-minyak lainnya.

Fungsi bahan yang digunakan pada pembuatan media kultur jaringan ini:

1.    Unsur Besi (Fe)

Unsur Fe dibutuhkan sedikit banyak dari pada unsur mikro lainnya.  Pada medium unsur Fe ini berfungsi untuk menyangga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman pada tanaman.  Unsur ini berfungsi untuk pernafasan pembentukan hijau daun.

2.    Unsur Sukrosa

Sukrosa pada media kultur jaringan berfungsi sebagai sumber energi yang diperlukan untuk inkubasi kalus.

3.    Unsur Mio-inositol

Penambahan Mio-inositol pada medium bertujuan untuk membantu differensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan.

4.    Unsur Vitamin

Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam kultur jaringan adalah Tiamin (vitamin B₁), Piridoksin (vitamin B₆) dan asam nikotonat.  Tiamin berfungsi untuk mempercepat pembelahan sel pada meristem akar juga berperan dalam koenzim dalam reaksi yang menghasilkan energi dari karbohidrat dan memindahkan energi.

5.    Unsur-unsur Asam Amino

Asam amino berperan penting untuk pertumbuhan dan differensiasi kalus.  Kebutuhan asam amino untuk setiap tanaman berbeda-beda.

6.    Unsur Zat Pengatur Tumbuh

Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa organik bukan hara yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan merubah proses fisiologi tumbuhan.  Zat pengatur tumbuh dalam tanaman terdiri dari lima kelompok yaitu Auksin, Gibberelin, Sitokinin, Etilen dan inhibitor dengan ciri khas serta pengaruh berlainan terhadap proses fisiologi.

Zat pengatur tumbuh tanaman berperan penting dalam mengontrol proses biologi dalam jaringan tanaman (Davies, 1995; Gaba, 2005). Perannya antara lain mengatur kecepatan pertumbuhan dari masing-masing jaringan dan mengintegrasikan bagian-bagiantersebut guna menghasilkan bentuk yang kita kenal sebagai tanaman. Aktivitas   zat pengatur tumbuh di dalam pertumbuhan tergantung dari jenis, struktur kimia, konsentrasi, genotipe tanaman serta fase fisiologi tanaman (Satyavathi et al., 2004; George, 1993; Dodds dan Roberts, 1982)

Sukrosa sering ditambahkan pada media kultur jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus. Sukrosa dengan konsentrasi 2 % - 5 % merupakan sumber karbon. Penggunaan sukrosa diatas kadar 3 % menyebabakan terjadinya penebalan dinding sel. Pengaruh rangsangan dari gula terhadap pertumbuhan ditentukan oleh cara sterilisasinya. Penggunaan autoclave untuk sterilisasi dapat memberikan pengaruh baik atau buruk terhadap pertumbuhan, tergantung dari gula yang digunakan sdalam media tersebut (Daisy dan Ari, 2002)

Medium kultur jaringan ditambahkan pemadat yaitu menggunakan agar-agar.  Keuntungan penggunaan agar-agar adalah:

-          Agar membeku pada temperatur kurang dari 45^oC, sehingga dalam kisaran temperatur kultur dalam keadaan beku yang stabil.

-          Tidak dicerna oleh enzim makanan

-          Tidak bereaksi dengan persenyawaan penyusun medium.

E.     KESIMPULAN

1.      Pembuatan larutan stok yang terdiri dari unsur hara makro dan unsur hara mikro harus dilakukan secara teliti dan berurutan, jika bahan-bahan tersebut dimasukkan secara bersamaan maka akan menimbulkan reaksi pengendapan (persipitat).

2.      Salah satu faktor yang mempengaruhi media yaitu pH.  Apabila ph terlalu tinggi maka akan menyebabkan media menjadi keras (media padat).  Demikina pula jika pH terlalu rendah, maka media akan menjadi sangat lembek.  pH optimal yaitu 5,8.

3.      Media ini terdiri dari berbagai larutan stok, diantaranya larutan stok A atau unsur hara makro (NH₄NO_3, KNO_3, C_aCl_2, 2H₂O, M_gSO_4, 7H₂O dan KH₂PO₄), larutan stok B atau unsur hara mikro (M_nSO_4, 4H₂O, Z_nSO_4, 4H₂O, H₃BO_3, Kl, N_aM₀O_4, 2H₂O, C_uSO_4, H₂O, dan C₀Cl_2. 6H₂O), larutan stok C (FeSO4.7H2O, Na2-EDTA), larutan stok D atau vitamin (Mio-inositol), larutan stok E (ZPT), glukosa, dan agar.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2007. Kultur Jaringan http://dinyunita-kuljar.blogspot.com. Diakses pada 11 Desember 2009.

Gaba, V.P. 2005. Plant Growth Regulator. In R.N. Trigiano D.J. Gray (eds.) Plant

Tissue Culture and Development. CRC Press. London. p. 87-100.

George, E.F. 1993. Plant Propagation by Tissue Culture. Part 1. The Technology   Exegetic. England. p. 1361.

Hendaryono, D.S dkk. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Penerbit Kanisius, Yogyakarta.

Mardin, S. 2005. Handout Kultur Jaringan Tanaman Hortikultura. Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.

Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius, Yogyakarta.

Wetherell, D.F. 1982. Pengantar Propagansi Tanaman Secara In Vitro. Semarang: IKIP Semarang Press.