LAPORAN
PRAKTIKUM
KULTUR JARINGAN
ACARA II
PEMBUATAN MEDIA
Semester
:
Genap 2012/2013
Oleh:
Nama : Yunita Fajri Pertiwi
NIM : A1L011128
Rombongan : E
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN
KEBUDAYAAN
UNIVERSITAS
JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS
PERTANIAN
PURWOKERTO
2012
A.
JUDUL : PEMBUATAN MEDIA
B.
PENDAHULUAN
a.
Latar Belakang
Prinsip dasar
kultur jaringan tanaman adalah bahwa setiap sel dalam tubuh organisme merupakan
suatu unit otonom yang totipotensi, yaitu kemampuan tipa sel yang berasal dari
semua bagian tanaman untuk tumbuh menjadi tanaman sempurna jika di letakkan
pada media dan lingkungan yang sesuai.
Keberhasilan kultur jaringan
ditentukan oleh media tanam dan jenis tanaman. Campuran media yang satu mungkin
cocok dengan jenis tanaman tertentu, namun tidak cocok untuk jenis tanaman yang
lain. Hal ini disebabkan karena setiap spesies tanaman dan bagian dari tanaman
mempunyai kemampuan yang tidak sama dalam mensintesa atau merombak zat- zat
yang menyusun media. Oleh karena itu tidak ada formulasi yang sesuai untuk
semua jenis tanaman yang menyebabkan diciptakannya
berbagai macam media yang disesuaikan dengan jenis tanaman yang akan
dikulturkan (Hendaryono, 1994).
Media kultur
jaringan merupakan tempat tumbuh bagi eksplan .Untuk menjamin pertumbuhan eksplan yang ditanam,
media kultur jaringan tanaman harus berisi semua zat yang diperlukan media tersebut dan harus berisi garam
mineral berupa unsur makro dan mikro, gula, protein, vitamin, dan hormon
tumbuh.
Media kultur jaringan harus mengandung unsur hara makro
dan unsur hara mikro dalam kadar perbandingan tertentu, sumber energi
(sukrosa), satu atau dua macam vitamin dan zat pengatur tumbuh. Unsure-unsur
yang diberikan dalam bentuk garam organic, unsure hara makro sangat menunjang
pertumbuhan jaringan dan diberikan dalm
jumlah banyak dari unsur mikro. Unsur hara mikro meliputi Nitrogen (N), Fosfor
(P), Kalium (K), Sulfur(S), Kalsium (Ca), dan Magnesium (Mg), Seng(Zn), Bor(B),
molibdemnum (mo).
Zat pengatur tumbuh (ZPT) sangat
diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan differensiasi. Tanpa
penambahan ZPT dalam medium, pertumbuhan mungkin terhambat bahakan tidak
tumbuh. Golongan auksin yang sering
digunakan pada medium kultur jaringan adalah 2,4D, IAA, NAA, dan IBA. Sedangkan
dari golongan sitokinin adalah kinetin, zeatin, BAP. Konsentrasi yang digunakan
untuk masing-masing tanaman dan bagian tanaman tidak sama.
Tanaman memerlukan makanan yang sering disebut hara
tanaman (plant nutrient). Tanaman menggunakan bahan anorganik untuk mendapatkan
energi dan pertumbuhannya. Dengan fotosintesis, tanaman mengumpulkan karbon
yang ada di atmosfir yang kadarnya sangat rendah, ditambah dengan air diubah
menjadi bahan organik oleh klorofil dengan bantuan sinar matahari. Unsur yang
diserap untuk pertumbuhan dan metabolisme tanaman dinamakan hara tanaman.
Mekanisme pengubahan unsur hara menjadi senyawa organik atau energi disebut
metabolisme (Anonim, 2007).
Nutrisi dasar untuk kultur
sel tanaman pada dasarnya mirip dengan nutrisi yang dibutuhkan oleh tanaman itu
sendiri. Namun,
variasi komposisi nutrisi tergantung
pada sel-sel, jaringan-jaring, organ-organ dan protoplasma serta jenis
tanaman yang akan dikulturkan. Komposisi media
yang diguanakan untuk menumbuhkan eksplan harus mengandung nutrien esensial
makro dan mikro dengan perbandingan komposisi tertentu yang sesuai dengan
kebutuhan jenis dan varietas tanaman yang dijadikan eksplan. Nutrien esencial
makro terdiri atas 6 elemen makro nutrien yang terdiri atas: nitrogen, kalium,
magnesium, kalsium, belerang dan fosfor serta tujuh eleven mikro yang terdiri
atas besi, mangan, seng, tembaga, boron, molibden, dan khlor dalam bentuk
ikatan kimia dan perbandingan yang sesuai (Wetherell, 1982)
b.
Tujuan
Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa dapat:
1.
Mengetahui dan mempraktikan
cara membuat larutan stok.
2.
Mengetahui dan mempraktikan
cara membuat media MS.
3.
Melakukan sterilisasi medium.
C.
METODE PELAKSANAAN
Tempat pelaksanaan :
Di ruang lab pemuliaan tanaman.
Waktu :
28 november 2012
a.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam pembuatan media MS
adalah tabung erlenmeyer, gelas ukur, pipet ukur, pengaduk, magnetic stirer,
kompor, pH meter, timbangan analitik, autoclave, dan alumunium foil, seal, dan
kertas payung.
Bahan yang digunakan dalam pembuatan media MS
adalah unsur hara makro : 1900 mg/l KNO3, 1650 mg/l NH4NO3, 440 mg/l CaCl2. 2
H2O, 370 mg/l MgSO4, 170 mg/l ; unsur
hara mikro : MnSO4. 4 H20 22,3 mg/l, ZnSO4. 7 H2O 8,6 mg/l, M3BO3 6,2 mg/l, KI
0,83 mg/l, Na2MoO4.2H20 0,25 mg/l, CuSO4.5H20 0,025 mg/l ; besi : FeSO4.7H2O
27,8 mg/l, Na2-EDTA.2H2O 37,3 mg/l ; vitamin : Mio-inositol 100 mg/l, Thiamin
HCl 0,1 mg/l, Asam nikotinat 0,5 mg/l, Piridoksin HCl 0,5 mg/l, Glisin 2 mg/l ;
ZPT : sitokinin 1 mg/l, auksin 1 mg/l ; bahan pemadat (agar) : 7 gr/l ; sukrosa
: 30 gr/l ; KOH atau NaOH : 1 M ; HCl : 1 M.
a. Prosedur Kerja
1. Pembuatan Larutan Stok
a.
Larutan stok A merupakan
larutan hara makro, dibuat 10 kali dilarutkan sampai 1000 ml aquades.
b.
Larutan stok B merupakan
larutan hara mikro, dibuat 1000 kali
dilarutkan dalam 100 ml aquades.
c.
Larutan stok C merupakan
campuran FeSO4.7H2O dan Na2-EDTA, dibuat 100
kali dan dilarutkan kedalam 200ml aquades.
d.
Larutkan stok D merupakan
larutan vitamin kecuali mio-inositol, dibuat 100 kali dalam 200 ml aquades.
e.
Larutan stok E merupakan
larutan mio-inositol , dibuat 100 kali dan dilarutkan ke dalam 100 ml aquades.
f.
Larutan stok F merupakan
larutan ZPT, dibuat 100 kali dilarutkan kedalam 500 ml aquades.
2. Pembuatan
Media MS
a.
Aquades sebanyak 500 ml dipersiapkan di dalam
erlenmeyer ukuran 1000 ml. Larutan stok A, B, C, D, E, dan F dimasukkan kedalam
erlenmeyer sesuai dengnan yang dibutuhkan. Untuk pembuatan 1 liter medium, maka
stok A diambil sebanyak 100 ml, stok B 0,1 ml, stok C 2 ml, stok D 2 ml, stok E
1 ml, dan stok F 5 ml. Semua larutan dicampur sambil digoyangkan wadahnya agar
semua bahan kimia tersebut larut.
b.
Sukrosa ditimbang sebanyak 30 gr dan dimasukkan
ke dalam erlenmeyer (pada pointa) sambil diaduk sampai homogen.
c.
Aquades ditambahkan sampai volumenya 1000 ml.
d.
pH larutan diukur dengan menggunakan pH meter
elektrik atau kertas lakmus, pH yang diutuhkan sekitar 5,7-5,8. Jika terlalu
asam maka larutan ditambahkan KOH atau NaOH 1 M dan jika terlalu basa dapat
ditambahkan HCl 1 M. Penambahan bahan tersebut dilakukan hingga pH yang
diinginkan tercapai.
e.
Agar-agar ditambahkan ke dalam larutan tersebut
sebanyak 7 gr, lalu dipanaskan di atas kompor sampai mendidih sambil di
aduk-aduk.
f.
Medium dituangkan ke dalam botol kultur sekitar
20 ml per botol tergantung ukuran botol.
g.
Botol ditutup dengan alumunium foil kemudian
direkatkan menggunakan seal.
3.
Sterilisasi Media
a.
Botol kultur yang sudah berisi medium
dimasukkan ke dalam autoclave untuk disterilisasi dengan tekanan botol 15-17,5 psi
pada suhu 120ºC selama 20 menit sampai tiga kali.
b.
Setelah disterilkan, botol-botol yang berisi
medium diangkat dan disimpan dalam ruangan sejuk sampai siap digunakan..
c.
Medium siap digunakan, namun untuk mengetaui
ada tidaknya kontaminasi dalam medium sebalikya.
D.
PEMBAHASAN
Beberapa macam media
dasar yang dikenal antara lain (Hendaryono, 1994):
1.
Médium dasar Murashige dan Skoog (MS). Media ini
mempunyai konsentrasi garam – garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam
bentuk NO3- dan NH4+.
2.
Médium dasar B5 atau Gamborg. Digunakan untuk kultur
suspensi sel bangsa legume.
3.
Médium dasar white. Digunakan untuk kultur akar
mengandung konsentrasi garam – garam mineral yang rendah.
4.
Médium Vacin Went (VW). Digunakan sebagai médium
anggrek.
5.
Médium dasar Nitsch dan Nitsch. Digunakan untuk
kultur tepungsari (pollen) dan kultur sel.
6.
Médium dasar Schenk dan Hildebrandt. Digunakan untuk
kultur jaringan tanaman monokotil.
7.
Médium dasar Woody Plant Médium (WMP). Digunakan
untuk tanaman berkayu.
8.
Médium dasar N6. Digunakan untuk tanaman serealia
terutama padi.
Media
dasar terdapat dalam bentuk kemasan dan lebih praktis, Namur karena harganya
masih relatif mahal, maka para peneliti berupaya meramu komposisi media
sendiri. Untuk unsur makro komposisi masing – masing campurannya cukup
ditimbang.
Praktikum kali
ini dalam pembuatan media ini adalah menggunakn media MS, dari berbagai
komposisi dasar ini kadang-kadang dibuat
modifikasi, misalnya hanya menggunakan (½ MS), atau menggunakan komposisi garam
–garam makro berdasarkan MS tetapi mikro dan vitamin berdasarkan komposisi
Heller. Zat pengatur tumbuh yang akan digunakan disesuaikan dengan tujuan inisiasi kultur, setelah rencana media tanam
dimantapkan, dibuat laruta stok yang pekat.
Praktikum kali ini yaitu melakukan pembuata media
Murashige and Skoog (MS). Media ini
terdiri dari berbagai larutan stok, diantaranya larutan stok A atau unsur hara
makro (NH4NO3, KNO3,
CaCl2, 2H2O, MgSO4, 7H2O
dan KH2PO4), larutan stok B atau unsur hara mikro (MnSO4, 4H2O,
ZnSO4, 4H2O, H3BO3, Kl,
NaM0O4, 2H2O, CuSO4,
H2O, dan C0Cl2. 6H2O), larutan stok C (FeSO4.7H2O,
Na2-EDTA), larutan stok D atau vitamin (Mio-inositol,
air kelapa), larutan stok E (ZPT), glukosa, dan agar. Pembuatan larutan stok ini bertujuan untuk
memudahkan penimbangan bahan-bahan yang digunakan karena penggunaannya yang
sangat sedikit. Larutan stok ini
mempunyai kepekatan yang sangat tinggi sehingga pemakaiannya harus disesuaikan
dengan kebutuhan (Mardin, 2005).
Penambahan Mio-inositol pada media
kultur bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan.
Bila mio-inositol diberikan bersama auksin, kinetin dan vitamin, maka dapat
mendorong pertumbuhan jaringan kalus (Daisy dan Ari, 2002).
Larutan stok
adalah larutan bahan media yang dibuat dalam jumlah atau volume besar. Pembuatan larutan stok bertujuan untuk
menghemat pekerjaan menimbang bahan yang berulang-ulang setiap kali membuat
media. Larutan stok sebaiknya disimpan
di tempat yang bertemperatur rendah dan gelap (dianjurkan untuk disimpan dalam
lemari es).
Fungsi kandungan unsur makro
1. KNO3
Berfungsi memperkuat tubuh tanaman, karena unsur KNO3
ini dapat menguatkan serabut-serabut akar, sehingga daun, bunga dan buah tidak
mudah gugur. Disamping itu juga berfungsi memperlancar memetabolisme dan
mempengaruhi penyerapan makanan.
2. NH4NO3
Berfungsi menyuburkan tanaman sabab dapat membentuk
protein, lemak dan berbagai persenyawaan organik lainnya. NH4NO3
juga digunakan dalam pertumbuhan vegetative tanaman, pembentukan hijau daun
yang sangat dimanfaatkan dalam proses fotosintesis.
3. CaCl2.2H2O
Berfungsi merangsang pembentukan bulu-bulu akar,
mengeraskan batang dan merangsang pembentukan biji.
4. MgSO4.7H2O
Berfungsi dengan terbentuknya sejumlah protein maka pertumbuhan daun
menjadi hijau, terbentuk karbohidrat, lemak serta minyak-minyak lainnya.
Fungsi bahan yang digunakan pada pembuatan media kultur jaringan
ini:
1. Unsur Besi (Fe)
Unsur Fe dibutuhkan sedikit banyak dari pada unsur mikro
lainnya. Pada medium unsur Fe ini
berfungsi untuk menyangga kestabilan pH media selama digunakan untuk
menumbuhkan jaringan tanaman pada tanaman.
Unsur ini berfungsi untuk pernafasan pembentukan hijau daun.
2. Unsur Sukrosa
Sukrosa pada media kultur jaringan berfungsi sebagai
sumber energi yang diperlukan untuk inkubasi kalus.
3. Unsur Mio-inositol
Penambahan Mio-inositol pada medium bertujuan untuk
membantu differensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan.
4. Unsur Vitamin
Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam kultur
jaringan adalah Tiamin (vitamin B1), Piridoksin (vitamin B6)
dan asam nikotonat. Tiamin berfungsi
untuk mempercepat pembelahan sel pada meristem akar juga berperan dalam koenzim
dalam reaksi yang menghasilkan energi dari karbohidrat dan memindahkan energi.
5. Unsur-unsur Asam Amino
Asam amino berperan penting untuk pertumbuhan dan
differensiasi kalus. Kebutuhan asam
amino untuk setiap tanaman berbeda-beda.
6. Unsur Zat Pengatur Tumbuh
Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa organik
bukan hara yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan merubah
proses fisiologi tumbuhan. Zat pengatur
tumbuh dalam tanaman terdiri dari lima kelompok yaitu Auksin, Gibberelin, Sitokinin,
Etilen dan inhibitor dengan ciri khas serta pengaruh berlainan terhadap proses
fisiologi.
Zat pengatur tumbuh tanaman berperan penting dalam
mengontrol proses biologi dalam jaringan tanaman (Davies, 1995; Gaba, 2005).
Perannya antara lain mengatur kecepatan pertumbuhan dari masing-masing jaringan
dan mengintegrasikan bagian-bagiantersebut guna menghasilkan bentuk yang kita
kenal sebagai tanaman. Aktivitas zat
pengatur tumbuh di dalam pertumbuhan tergantung dari jenis, struktur kimia,
konsentrasi, genotipe tanaman serta fase fisiologi tanaman (Satyavathi et
al., 2004; George, 1993; Dodds dan Roberts, 1982)
Sukrosa sering ditambahkan pada media
kultur jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus.
Sukrosa dengan konsentrasi 2 % - 5 % merupakan sumber karbon. Penggunaan sukrosa
diatas kadar 3 % menyebabakan terjadinya penebalan dinding sel. Pengaruh
rangsangan dari gula terhadap pertumbuhan ditentukan oleh cara sterilisasinya.
Penggunaan autoclave untuk sterilisasi dapat memberikan pengaruh baik atau
buruk terhadap pertumbuhan, tergantung dari gula yang digunakan sdalam media
tersebut (Daisy dan Ari, 2002)
Medium kultur jaringan ditambahkan pemadat yaitu
menggunakan agar-agar. Keuntungan
penggunaan agar-agar adalah:
-
Agar membeku pada temperatur
kurang dari 45oC, sehingga dalam kisaran temperatur kultur dalam
keadaan beku yang stabil.
-
Tidak dicerna oleh enzim
makanan
-
Tidak bereaksi dengan
persenyawaan penyusun medium.
E.
KESIMPULAN
1.
Pembuatan larutan stok yang
terdiri dari unsur hara makro dan unsur hara mikro harus dilakukan secara
teliti dan berurutan, jika bahan-bahan tersebut dimasukkan secara bersamaan
maka akan menimbulkan reaksi pengendapan (persipitat).
2.
Salah satu faktor yang
mempengaruhi media yaitu pH. Apabila ph
terlalu tinggi maka akan menyebabkan media menjadi keras (media padat). Demikina pula jika pH terlalu rendah, maka
media akan menjadi sangat lembek. pH
optimal yaitu 5,8.
3.
Media ini terdiri dari berbagai
larutan stok, diantaranya larutan stok A atau unsur hara makro (NH4NO3, KNO3, CaCl2,
2H2O, MgSO4, 7H2O dan KH2PO4), larutan stok B atau unsur
hara mikro (MnSO4, 4H2O, ZnSO4,
4H2O, H3BO3, Kl, NaM0O4,
2H2O, CuSO4, H2O, dan C0Cl2.
6H2O), larutan stok C (FeSO4.7H2O, Na2-EDTA), larutan
stok D atau vitamin (Mio-inositol), larutan stok E (ZPT), glukosa, dan agar.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2007. Kultur Jaringan http://dinyunita-kuljar.blogspot.com. Diakses
pada 11 Desember 2009.
Gaba, V.P. 2005. Plant Growth Regulator. In R.N.
Trigiano D.J. Gray (eds.) Plant
Tissue Culture and Development. CRC Press. London. p.
87-100.
George, E.F. 1993. Plant Propagation by Tissue Culture.
Part 1. The Technology Exegetic.
England. p. 1361.
Hendaryono, D.S dkk. 1994. Teknik
Kultur Jaringan. Penerbit
Kanisius, Yogyakarta.
Mardin, S. 2005. Handout Kultur Jaringan Tanaman Hortikultura.
Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.
Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002. Teknik Kultur Jaringan :
Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern.
Kanisius, Yogyakarta.
Wetherell, D.F. 1982. Pengantar
Propagansi Tanaman Secara In Vitro. Semarang: IKIP Semarang Press.